Wykrywanie nowego koronawirusa 2019 (2019-nCoV) za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym separator komentowanie niedostępne
Victor M Corman \ Olfert Landt
Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) chińskie biuro WHO zostało poinformowane o przypadkach zapalenia płuc o nieznanej etiologii w mieście Wuhan w prowincji Hubei w dniu 31 grudnia 2019 r. [ 1 ].
Nowy koronawirus o nazwie obecnie 2019-nCoV został oficjalnie ogłoszony przez chińskie władze 7 stycznia jako czynnik sprawczy. W dniu 10 stycznia wydano sekwencję genomu wirusowego w celu natychmiastowego wsparcia zdrowia publicznego za pośrednictwem społeczności online virological.org (Wuhan-Hu-1, numer dostępu GenBank MN908947 [ 2]), a następnie cztery inne genomy zdeponowane 12 stycznia w bazie danych sekwencji wirusów, której kuratorem jest Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID).
Sekwencje genomu sugerują obecność wirusa blisko spokrewnionego z członkami gatunku wirusa zwanego CoV związanym z ciężkim ostrym zespołem oddechowym (SARS), gatunkiem zdefiniowanym przez czynnik wybuchu SARS w 2002/03 u ludzi [ 3 , 4 ] . Gatunek ten obejmuje również dużą liczbę wirusów wykrywanych głównie u nietoperzy nosorożców w Azji i Europie.
Na dzień 20 stycznia 2019 r. WHO zgłosiło 282 potwierdzonych laboratoryjnie przypadków u ludzi [ 5 ].
Potwierdzone przypadki podróżujących z Wuhan ogłoszono 13 i 17 stycznia w Tajlandii, a także 15 stycznia w Japonii i 19 stycznia w Korei. Zakres przeniesienia człowieka na człowieka w 2019 r. NCoV jest niejasny w chwili pisania tego raportu, ale istnieją dowody na pewne przeniesienie z człowieka na człowieka.
Jednym z najważniejszych priorytetów ułatwiających interwencje w zakresie zdrowia publicznego jest wiarygodna diagnostyka laboratoryjna. W ostrej infekcji dróg oddechowych rutynowo stosuje się RT-PCR do wykrywania wirusów wywołujących wydzieliny oddechowe. Wcześniej wykazano możliwość wprowadzenia solidnej technologii wykrywania w oparciu o czasie rzeczywistym RT-PCR w laboratoriach zdrowia publicznego podczas międzynarodowych zagrożenia zdrowia przez koordynację między laboratoriami publicznych i akademickich.
We wszystkich tych sytuacjach izolaty wirusa były dostępne jako podstawowy substrat do ustanawiania i kontrolowania testów i ich wydajności.
W obecnym przypadku 2019-nCoV izolaty wirusa lub próbki od zainfekowanych pacjentów nie były jak dotąd dostępne dla międzynarodowej społeczności zdrowia publicznego. Podajemy tutaj informacje na temat ustanowienia i zatwierdzenia przepływu pracy diagnostycznej do badań przesiewowych nCoV 2019 i konkretnego potwierdzenia, zaprojektowanego w przypadku braku dostępnych izolatów wirusa lub oryginalnych próbek pacjentów. Projekt i walidacja były możliwe dzięki ścisłemu powiązaniu genetycznemu z SARS-CoV z 2003 r., A także dzięki zastosowaniu technologii syntetycznych kwasów nukleinowych.
Metody Przejdź
Próbki kliniczne i supernatanty hodowli komórkowej koronawirusa do wstępnej oceny testu
Supernatanty hodowli komórkowej zawierające typowe koronawirusy i inne wirusy układu oddechowego zostały dostarczone przez laboratoria badawcze Charité i University of Hong Kong. Próbki oddechowe zostały pobrane w 2019 r. Od pacjentów hospitalizowanych w centrum medycznym Charité i przetestowane przez panel patogenów układu oddechowego NxTAG (Luminex, S´Hertogenbosch, Holandia) lub w przypadkach MERS-CoV za pomocą testu MERS-CoV upE opublikowanego wcześniej [ 10 ].
Dodatkowe próbki wybrano z biobanków w Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM), Bilthoven, w Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Public Health England (PHE), Londyn i na University of Hong Kong. Próbki ze wszystkich kolekcji obejmowały plwocinę oraz wymazy z nosa i gardła z lub bez wirusowego podłoża transportowego.
Próbki kału zawierające pochodzące od nietoperza próbki CoV związane z SARS (oznaczone numerami dostępu GenBank) zostały przetestowane: KC633203, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_eur / BB98–98 / BGR / 2008; KC633204, Betakoronawirus BtCoV / Rhi_eur / BB98–92 / BGR / 2008; KC633201, Betakoronawirus BtCoV / Rhi_bla / BB98–22 / BGR / 2008; GU190221 Betakoronawirus Nietoperz koronawirus BR98–19 / BGR / 2008; GU190222 Betakoronawirus Nietoperz koronawirus BM98–01 / BGR / 2008; GU190223, koronawirus wirusa nietoperza Betacoronavirus BM98–13 / BGR / 2008.
Wszystkie syntetyczne RNA użyte w tym badaniu zostały oszacowane fotometrycznie.
Ekstrakcja RNA
RNA ekstrahowano z próbek klinicznych za pomocą systemu
Zeptometrix Nattrol Coronavirus control / Gentaur Sp z o.o.
